挥发性档案防霉剂防霉效果测定法

1范围
本标准规定了挥发性档案防霉剂防霉效果测试材料、仪器设备、测试条件、测试方法、结果评定等内容。
本标准适用于挥发性档案防霉剂防霉效果的测定。

2测试用品与设备
2.1用品
2.1.1培养基
2.1.2供试菌种
2.1.3受试底物
2.1.4医用喷雾器
2.1.5医用剪刀
2.1.6医用纱布
2.1.7小试管(15mm×150mm)
2.1.8培养皿(90mm)
2.1.9移液管(吸管)(1mL)
2.1.10三角烧瓶(250mL、500mL)
2.1.11烧杯(250mL、500mL、1000mL)
2.1.12量筒(100mL、500mL、1000mL)
2.1.13带盖的圆柱形玻璃器皿(容积约为1200mL)
2.2设备
2.2.1手提医用消毒器
2.2.2架盘天平
2.2.3电热干燥箱
2.2.4恒温恒湿培养箱
2.2.5电冰箱
2.2.6无菌操作台或无菌室

3测试条件
3.1温度28℃±2℃。
3.2湿度RH≥93%。
3.3培养基
土豆汁培养基(配方见附录A)。
3.4菌种
杂色曲霉(Aspergillus Versicolor)
黑曲霉(Aspergillus niger)
产黄青霉(Penicillium chrysogenum)
桔青霉(Penicillium citrinum)
球毛壳霉(Chaetomium globasum)
腊叶芽枝霉(Cladosporium herbarum)
绿色木霉(Trichoderma viride)
宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)
3.5菌量(见附录C)
混合孢子悬浮液浓度:1×105个/mL～1×107个/mL。
3.6底物
宣纸、卡纸、书写纸、牛皮纸、漆纸、漆布(尺寸大小为20mm×30mm)，胶片、录像带(尺寸大小为自然宽度×30mm)。
3.7药量
1000mL体积中悬挂1.0g(即1000mg)药物。
3.8时间
放置28天。

4测试方法
4.1消毒器皿
先用清水中加入数滴洗涤剂的洗洁液浸洗圆柱玻璃器皿，再用清水冲洗，最后用75%乙醇涂擦消霉，待干，备用。
4.2准备无菌水
准备好带玻璃珠的无菌生理盐水和不带玻璃珠的无菌水若干瓶。即在250mL三角瓶中注人100mL生理盐水，并放人几十粒玻璃珠，灭菌(参见附录B)。在250mL三角瓶中注人200mL自来水，同样灭菌。
4.3制备霉菌孢子悬浮液(见附录D)
在无菌室或无菌操作台，在火焰旁，用接种环分别挑取8株供试霉菌，接人带上述玻璃珠的无菌生理盐水中，用手振荡3min～5min，使孢子充分分散，复制成1×105个/mL～1×107个/mL的霉菌孢子悬浮液，备用。
4.4放置样品(见图1)
4.4.1在适当的玻璃器皿内，悬挂受试底物，并喷洒霉菌孢子悬浮液(以表面湿润为宜)，晾干，备用。
4.4.2在圆柱形玻璃器皿底部倒人200mL左右的无菌水(其目的是保持湿度，同时占去多余容积，使玻璃器皿内的空间容积正好为1000mL。
4.4.3将1.0g挥发性防霉剂用二层纱布或无纺布包裹后悬挂于玻璃器皿中央部位。
4.4.4在防霉剂周围悬挂受试底物(间隔至少1cm，不能相互接触)
4.4.5将玻璃器皿瓶口用盖子盖紧(或用透明复合塑料膜包扎)，保持密封。
4.4.6将玻璃器皿置于恒温恒湿培养箱内，在28℃±2℃，RH≥95%条件下，培养28天。
4.5空白对照
在圆柱形玻璃器皿中央部位不悬挂挥发性防霉剂，重复上述步聚，作空白对照。
当空白对照容器内的受试底物发霉严重时(即长霉程度++～+++)，测试有效，否则必须重做。
 

5结果测定

用肉眼观察长霉程度并进行等级评定(见表1)。

表1：长霉程度和等级
 

菌丝生长情况

 长霉程度

 长霉等级

试样表面看不到菌丝生长

 - 

0级

试样表面看到菌丝生长，但菌丝生长面积不超过全面积的三分之一

+ 

 1级

试样表面看到菌丝生长，菌丝生长面积超过全面积的三分之一，但不超过全面积的三分之二 

++ 

2级

试样表面看到菌丝生长，菌丝生长面积超过全面积的三分之二

+++

  3级

附录A

(标准的附录)

培养基的配制与灭菌
 

A1培养基的配制
培养基从形式区分有固体培养基和液体培养基，从内容区分有合成培养基和天然培养基等。其配制步聚为:
a)物料称量
明确培养基的组成部分，根据需要配制的量计算好各成分的重量，逐一称取。
b)溶解
一般情况下，可将几种原料和药品一起放大烧杯内调匀，并定容到需要的体积。
c)调节pH
微生物生长需要合适的pH，通常用1mol/L(1N)NaOH，1mol/L(1N)HCl或0.5mol/L(1N)H2S04调节pH至5.0。调节时要慢慢滴入，不断用pH试纸检查，至所需要的pH为止。
d)加热溶解
配制固体培养基一般加入2%的琼脂(俗称洋菜)，与培养基一起加热溶解。加入琼脂后，须不断搅拌，以免琼脂粘底烧焦。
e)过滤
一般来说，培养基配制好后要过滤，滤去不溶物或块状物。过滤必须趁热进行，通常用4～6层纱布作滤层。无不溶物或块状物的培养基也可以不过滤。
f)分装
按照需要，分装进试管、培养皿或三角烧瓶中。一般只装到试管的1/5，培养皿中装入15mL～20mL，三角烧瓶装入一半量。
g)加棉花塞或纱布、绒布扎口
培养基灌装后，应在试管口或三角烧瓶口上加棉花塞或纱布、绒布扎口，其作用有二:一是阻止外界微生物进入，二是保证有良好的通气，以便微生物能不断获得无菌空气。
h)包扎
棉塞塞好后，试管扎成捆，同时在外面包扎上一层牛皮纸。三角烧瓶口也用牛皮纸包扎好，以防灭菌时冷凝水浸湿棉塞和灭菌后的灰尘侵入。
i)灭菌
一般情况下，培养基配制好后应立即灭菌，于1kg/cm2压力下消毒30min即可。如不及时灭菌，则应放人冰箱内保存。
灭菌时，必须先将压力器内的空气排放干净，否则，即使压力到了所规定的数值，还是达不到所需要的温度。
j)定形
固体培养基温度降到一定程度时便凝固成形。

A2霉菌培养基配方
霉菌培养基配方有多种，本标准采用土豆汁培养基，配方如下:
土豆(去皮)200g、水1000mL、琼脂20g、pH5。0
将土豆洗净去皮，称取200g，切成小块，加1000mL水煮沸1h，用双层纱布滤成清液。加水补充因蒸发而减少的水分。

附录B

(提示的附录)

玻璃器皿的清洗与灭菌

B1玻璃器皿的清洗
对买来的新试管、移液管、培养皿、三角烧杯、烧杯等玻璃器皿，先用水冲洗，然后放在5%的碱溶液内洗刷，再放在3%的盐酸溶液内中和，最后用水冲洗，晾干或烘干即可。
培养或污染过微生物的玻璃器皿，在洗涤之前，必须先进行消毒。一般采用高压灭菌，也可用常压煮沸或其他化学药品消毒。消毒后，将脏的培养物或其他污染物去掉，然后用清水冲洗，再在肥皂水中洗刷，最后用清水冲洗干净，晾干或烘干即可。
遇有不易洗刷干净的玻璃器皿，则可用硫酸重铬酸钾洗液浸渍后再清洗。其配方是:粗硫酸900mL，重铬酸钾(粗制)100g，自来水100mL。配制顺序是:先将自来水和重铬酸钾置于烧杯中，加热溶化，待冷却后，再以细流加入硫酸即可。
若玻璃器皿上有橡皮胶、封蜡、凡士林等物时，应另外处理，然后再按上述清洗过程洗涤。

B2玻璃器皿的灭菌
微生物试验中所用的玻璃器皿都可以采用高压灭菌。清洗干净的玻璃器皿晾干或烘干后分别进行封口、包扎，然后灭菌。
培养皿一般用牛皮纸包裹(10套一包)，用线扎牢，或装入特制的铝皮盒内。试管应先加棉花塞(采用脱脂棉)，棉塞的大小松紧要适宜，以便操作时易于拔取和塞回。最后装进试管筐内，上面包以牛皮纸。吸管(移液管)管口应先塞少许棉花，以免使用不慎将微生物吸入口中或橡皮吸球内。然后每支吸管都先用薄纸包卷，每10支吸管用牛皮纸包扎好。三角烧瓶瓶口用绒布(或几层纱布)及牛皮纸包扎好。其他玻璃器皿也都用牛皮纸包裹后再进行灭菌。
准备工作做好后，将玻璃器皿置高压灭菌器内，在1kg/cm2压力下消毒45min即可。灭菌后，取出，烘干，备用。
试管、培养皿、三角烧瓶等玻璃器皿以及金属用具也可施行干热灭菌。先用水洗涤干净，待干燥后塞上棉花或绒布，用牛皮纸包扎好，置电热干燥箱内，加热至150℃～170℃，约保持1h～2h。
 

附录C

(提示的附录)

活菌计数
 

C1步聚
a)用灭菌吸管吸取1mL霉菌孢子悬浮液注入9mL灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液体)，充分混匀，制成1：10稀释菌液。
b)用灭菌吸管吸取1mL1：10的霉菌孢子稀释液注入到另一支9mL灭菌生理盐水试管中，充分混匀，使成1：100稀释菌液。
c)根据霉菌孢子悬浮液的浓度，用同样方法，制成1：1 000、1：10 000、1：100 000、1：1 000 000,1：10 000 000等稀释菌液(每次稀释应更换一支来菌吸管)。
d)用灭菌吸管吸取上述稀释液各1mL分别注入灭菌培养皿中，每种稀释度应做3～5块培养皿。
e)将溶化并冷却至45℃左右的霉菌琼脂培养基放人各培养皿内(每皿约15mL～20mL)，随即晃动培养皿，使菌液与培养基充分混合，平放，待凝固。
f)将培养基凝固后的培养皿置于28℃±2℃的恒温培养箱内培养2～3天，取出，观察菌落并计数。

C2要求
操作必须在无菌室或无菌箱内进行。

C3计数
用肉眼观察，点数菌落数。由于霉菌不同于细菌和酵母，其菌落大，且扩展快，故计数时依每皿5～10个菌落为宜，少于或超过这一数字的培养皿可不作计数。每种稀释度的3～5块培养皿取其平均值。
应使用下列公式:
式中

X=(S/N)?M(个/mL)

X––每毫升霉菌孢子悬浮液的活菌数;

S––稀释度培养皿上出现的菌落总数;

N––培养皿的数目;

M––稀释倍数。

示例:

1：10 000 000(即1×10-7)稀释度5块培养皿上出现的菌落数分别为6、10、7、9、8，则每毫升霉菌孢子悬浮液的活菌数为:

X=〔(6+10+7+9+8)/5〕×10000000=80000000个/mL，即8×107个/mL

附录D

(提示的附录)
 

菌株接种与保藏
 

D1接种
菌株接种常用接种环或接种针。接种过程必须执行严格的无菌操作，通常在无菌室或无菌操作台上进行，并靠近火焰(煤气灯或酒精灯)操作。
斜面接种是从已生长好的菌种斜面上用接种环(或针)挑取少许菌落，把它们移接到另一支新鲜斜面培养基上。具体步聚是:
手持试管斜面→旋松棉塞→取接种环→拔棉花塞→环灼烧冷却→挑取菌种→接种→塞棉花塞→接种环灭菌。
将接种过的斜面培养基置于28℃±2℃恒温中培养，3～5天后取出。

D2保藏
菌种保藏方法有多种，常用的是斜面菌种保藏法。
霉菌一般保藏在土豆琼脂斜面或察氏琼脂斜面。通常存放于2℃～4℃的冰箱或冰库中，用此法可保存3个月，即3个月以后必须重新移植一次。